A PCR em tempo real (qPCR) tem sido amplamente utilizada no diagnóstico do Covid-19 (popularmente conhecido como Teste RT-PCR), porém essa técnica tem aplicações que vão desde o diagnóstico molecular até a análise de expressão gênica, quantificação de OGMs, genotipagem, monitoramento de contaminação, dentre outras.
A qPCR surgiu no início dos anos 2000 como uma técnica robusta, simples e com diversas vantagens em relação a outras técnicas quantitativas ou semi-quantitativas até então utilizadas por laboratórios de Biologia Molecular. Sua consolidação se deu ao longo das últimas duas décadas e, mesmo com o desenvolvimento de outras técnicas como a PCR digital e o sequenciamento de alto rendimento, a qPCR permanece uma sólida opção para os mais diferentes campos.
Alguns fatores que contribuem para isso são a alta confiabilidade, alta precisão dos resultados, a reprodutibilidade do ensaio, o custo-benefício em relação a outras técnicas disponíveis e a diversidade de aplicações. Nesse post falamos um pouco sobre 5 aplicações possíveis com o método de qPCR.
1. Análises de Expressão Gênica:
Para que a expressão gênica seja analisada utiliza-se o método de transcrição reversa (Reverse Transcription) para se obter cDNA a partir de RNA. Por isso, essa modalidade é também conhecida como RT-qPCR.
Com essa aplicação é possível verificar a quantidade de transcritos de um gene que está presente em diferentes amostras. Como a amplificação de uma sequência alvo pode ser verificada a cada ciclo da qPCR, quando amostras possuem diferentes quantidades iniciais de transcritos de um gene, as curvas de amplificação irão atingir o ciclo de quantificação (Cq) em diferentes momentos. Dessa forma, ao final é possível comparar a uma referência interna (Gene de Referência ou Housekeeping) e obter informações a respeito dos níveis de expressão do gene em estudo nas diferentes amostras.
Essa aplicação é amplamente utilizada quando se quer estudar o efeito de um tratamento nos níveis de expressão de um ou mais genes de uma determinada via metabólica, o comportamento da expressão gênica em células doentes ou os genes expressos ao longo do desenvolvimento de um organismo.
Essa é a aplicação utilizada no diagnóstico do Sars-Cov-2, ou Covid-19, uma vez que o vírus apresenta RNA como material genético e a quantidade de vírus presente no organismo (carga viral) é determinada a partir da análise de expressão gênica de alguns genes do vírus.
2. Detecção e quantificação de Organismos Geneticamente Modificados (OGM):
A detecção de um evento de transformação genética pode ser feita através de PCR comum, porém através da qPCR há a possibilidade de realizar análises quantitativas, como detectar a porcentagem de OGM em um lote de amostras. Essa análise é necessária para a exportação de grãos para países onde um determinado evento transgênico não é aprovado ou há um percentual máximo tolerado para este evento de OGM.
No desenvolvimento de organismos geneticamente modificados, os pesquisadores podem utilizar a qPCR para investigar a quantidade de cópias de um transgene inseridas nos cromossomos e estudar a homozigose dos eventos.
3. Genotipagem
A variabilidade genética tem sido amplamente estudada em programas de melhoramento genético e no estudo de doenças genéticas. Pesquisadores procuram descobrir a associação entre composição genética e fenótipos em estudos com foco em polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), variantes no número de cópias (CNVs), inserção / deleções (indels) e mutações somáticas. Dentre os métodos mais eficientes para a detecção de variabilidade genética está a qPCR, com ensaios utilizando sondas marcadas com fluoróforos (Taqman®) que podem ser predefinidos ou customizados.
Além disso, o ensaio de High Resolution Melt (HRM) é um método de análise pós-PCR relativamente novo usado para identificar variações nas sequências de ácido nucleico. O método é baseado na detecção de pequenas diferenças nas curvas de melting (dissociação) de PCR. Esse método é possível pelo uso de corantes intercalantes de dsDNA aprimorados usados ??em conjunto com instrumentação de PCR em tempo real que tem controle preciso da rampa de temperatura e recursos avançados de captura de dados. Os dados são analisados ??e manipulados usando um software projetado especificamente para análise de HRM.
4. Diagnóstico molecular
Apesar de ter se tornado popular pelo diagnóstico do Sars-Cov-2, a qPCR tem sido amplamente utilizada no diagnóstico molecular bem antes da pandemia, tanto para outras doenças infecciosas ou doenças que envolvam mutações no DNA ou o padrão desbalanceado da expressão gênica.
Um exemplo é o da leucemia mieloide crônica (LMC), que se caracteriza pela elevada expressão do transcrito BCR-ABL. Esse gene quimérico, produto da fusão dos genes BCR e ABL, pode não apenas ser detectado, firmando o diagnóstico da doença mieloproliferativa, mas ter seu nível de expressão aferido ao longo de determinada intervenção terapêutica.
Com a ampla disseminação da técnica no diagnóstico do Covid-19, a tendência é que cada vez mais o diagnóstico molecular através da qPCR seja utilizado pelos laboratórios.
5. Monitorar contaminações
Muitas doenças são causadas por contaminação por microorganismos patogênicos nos alimentos e água, e apesar da rigorosa legislação vigente, ainda é bastante comum a ocorrência de surtos alimentares. A deteção de contaminação por microorganismos em alimentos e águas é uma das mais importantes aplicações do método PCR.
Os métodos tradicionais de detecção de microorganismos envolvem um conjunto de análises para isolar, identificar e caracterizar os organismos presentes no material testado, sendo sujeitos a interpretação de resultados.
A qPCR é uma das técnicas moleculares disponíveis para detecção de contaminações, podendo ser realizados ensaios multiplex, em que uma vasta gama de bactérias, vírus e fungos podem ser detectados em uma única análise, como por exemplo Clostridium botulinum, Salmonella Enteritidis, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Giardia intestinalis, dentre outros. A detecção do Sars-Cov-2 em alimentos, nas embalagens ou no ambiente de produção também pode ser realizada via qPCR.
Conclusão
Neste artigo destacamos 5 aplicações possíveis com a PCR em Tempo Real, mas ainda existem muitas outras aplicações possíveis com essa versátil técnica que tem sido destacada recentemente pelo fato de ser considerada a melhor técnica disponível para o diagnóstico do Sars-Cov-2. Na codeSEQ somos especialistas nessa técnica. Além de muitos conteúdos gratuitos que disponibilizamos em nossas mídias, podemos realizar análises, consultorias, cursos e treinamentos. Entre em contato conosco.
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Referências:
https://www.fleury.com.br/medico/manuais-diagnosticos/hematologia-manual/pcr
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/taqman-assay-genetic-variation-research-br.pdf