Introdução:

Você provavelmente já ouviu falar na técnica de PCR, especialmente hoje em dia, visto que ela tem sido muito utilizada em testes de diagnóstico da Covid-19. Mas, você sabe que existem diferentes variações desta técnica? E que cada variação tem um termo específico para ser utilizado?

Não sabia? Não se preocupe. A grande maioria das pessoas também não sabe. Até mesmo aquelas que trabalham diretamente com Biologia Molecular às vezes confundem estes termos e os utilizam de forma errada. 

Por isso, reunimos aqui uma breve explicação de cada um destes termos para que você possa saber quando utilizar cada um deles. Então, vamos lá!

PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), é uma técnica que foi desenvolvida por Kary Mullis em 1983, sendo utilizada para fazer múltiplas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Nos laboratórios ela também é chamada de PCR convencional. O objetivo principal da PCR é gerar quantidade suficiente de um fragmento de DNA específico para que este possa ser utilizado ou analisado de acordo com seu interesse de forma qualitativa (presença ou ausência). Por exemplo, para diagnóstico de algum patógeno, controle de qualidade industrial, medicina forense, pesquisa científica, dentre outros. A partir dela foram desenvolvidas variações técnicas em seu uso, como a qPCR, RT-PCR, RT-qPCR, Stem-loop RT-qPCR. 

qPCR

O termo qPCR refere-se à Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (do inglês Polymerase Chain Reaction Quantitative Real Time). Esta variação da PCR convencional utiliza um agente fluorescente (Intercalantes de DNA ou Sondas de Hidrólise) que se liga ao fragmento de DNA específico de interesse e emite uma fluorescência, que será detectada por um aparelho próprio para este tipo de análise. Esta emissão de fluorescência aumenta a cada ciclo de amplificação e pode ser mensurada em tempo real, proporcionando uma mensuração da quantidade do seu fragmento presente na reação. Por isso, na qPCR é possível quantificar o DNA. Esta metodologia é mais rápida, sensível e específica comparada à PCR convencional, visto que a PCR convencional nos mostra apenas a presença ou ausência do seu fragmento de interesse analisado. 

RT-PCR

Este termo refere-se à Transcrição Reversa seguida de uma Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR, do inglês Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Neste método utiliza-se a enzima Transcriptase Reversa para converter RNA em DNA complementar (cDNA) para posteriormente compor a reação de PCR convencional, que é feita somente com uma molécula dupla fita. Muitas pessoas utilizam este termo de forma errada, confundindo RT-PCR com RT-qPCR. 

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Não confunda mais, o RT não é de Real Time, e sim de Reverse Transcription. O termo adequado para uma reação de PCR em Tempo Real para um produto da transcrição reversa vem logo após o video.

RT-qPCR

Este refere-se a Transcrição Reversa seguida de uma Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR, do inglês Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Quantitative Real Time). Neste método também se utiliza a enzima Transcriptase Reversa na conversão do RNA em DNA complementar (cDNA), e diferentemente da RT-PCR, este cDNA irá compor uma reação de qPCR, sendo esta reação analisada de forma quantitativa. Portanto, para se referir de forma correta ao teste de Covid-19, devemos falar no teste RT-qPCR, pois envolve uma transcrição reversa seguida de uma análise quantitativa por PCR em Tempo Real. 

Stem-loop RT-qPCR

Talvez você nunca tenha ouvido falar desse termo, mas ele também é um tipo de PCR baseada em transcrição reversa, porém é um método de RT-qPCR específico e sensível para análise de microRNAs. Os microRNAs são moléculas pequenas de RNA (17 a 24 nucleotídeos), que não codificam proteínas, e que atuam no controle pós transcricional da expressão de determinados genes. Por serem muito curtos, para que seja feita a etapa de conversão do microRNA em uma molécula dupla fita pela enzima Transcriptase Reversa, utiliza-se, além dos Primers Forward e Reverse, um primer específico RT que contém uma estrutura de haste-laço (Stem-loop) responsável por alongar o microRNA, proporcionando assim maior estabilidade na transcrição reversa. O restante da técnica ocorre normalmente como em uma reação de qPCR.

Viu só, apesar de diferir em apenas algumas poucas letras, esses termos possuem significados distintos, e cada um deles tem aplicações diferentes. Aliás, já leu nosso artigo sobre aplicações da qPCR? Clique aqui para ler agora mesmo.

Agora que você já sabe o significado de cada um, não vai mais errar. 

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